ĐỒNG HỮU CƠ THÚC ĐẨY TÍCH LŨY VÀ VẬN CHUYỂN ĐỒNG, TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH VÀ SỨC KHỎE SINH LÝ CỦA TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

Tác giả: Jinzhu Yang ^a, Zhonghao Zhang ^a, Gang Lin ^b, Mingzhu Li ^c, Yanjiao Zhang ^a, Kangsen Mai ^a.

^a The Key Laboratory of Aquaculture Nutrition and Feed (Ministry of Agriculture), The Key Laboratory of Mariculture (Ministry of Education), Ocean University of China, Qingdao, 266003, China

^b Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100081, China

^c College of Agriculture, Ludong University, Yantai, 264025, China

Điểm nổi bật

• Đồng hữu cơ có thể cải thiện sự tích lũy và vận chuyển đồng ở tôm thẻ chân trắng.
• Đồng hữu cơ có thể tăng cường khả năng chịu nhiệt độ thấp và sức khỏe sinh lý của tôm thẻ chân trắng.
• Đồng hữu cơ mang lại lợi ích tốt hơn ở mức 20 mg/kg so với đồng vô cơ ở mức 30 mg/kg.
• Mức đồng hữu cơ cao (40 mg/kg) không có tác dụng độc hại đối với tôm thẻ chân trắng.

Tóm tắt

Nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của nguồn và mức độ đồng trong khẩu phần ăn đến các chỉ tiêu huyết học, tích lũy và vận chuyển đồng, khả năng kháng nhiệt độ thấp, khả năng chống oxy hóa và đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei Boone, 1931). Bảy khẩu phần thí nghiệm với các nguồn và mức độ đồng khác nhau được tạo ra: C, không bổ sung đồng; S, 30 mg/kg đồng dưới dạng CuSO₄·5H₂O; SO, 15 mg/kg đồng từ CuSO₄·5H₂O + 7,5 mg/kg đồng từ Cu-proteinate; O1, O2, O3 và O4, lần lượt là 10, 20, 30 và 40 mg/kg đồng dưới dạng Cu-proteinate. Tổng cộng 840 con tôm (5,30 ± 0,04 g) được phân ngẫu nhiên vào 21 bể (3 bể/khẩu phần, 40 tôm/bể). Một thử nghiệm cho ăn kéo dài 8 tuần được tiến hành. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về hiệu suất tăng trưởng và thành phần hóa học của toàn con tôm giữa tất cả các nhóm. So với đồng vô cơ, đồng hữu cơ trong khẩu phần ăn (O2 và O3) làm tăng tổng protein, albumin và hàm lượng glucose trong huyết tương, đồng thời giảm triglyceride và cholesterol toàn phần trong huyết tương. Nồng độ đồng trong huyết tương và cơ cũng như biểu hiện gen của metallothionein và ATPase vận chuyển đồng 2 (ATP7b like) trong gan tụy cao hơn ở những con tôm được cho ăn đồng hữu cơ (SO, O2, O3 và O4). Tỷ lệ chết thấp nhất sau thử nghiệm thách thức nhiệt độ thấp (10°C) được quan sát thấy ở các nhóm O2 và O3. Đồng hữu cơ (SO, O2, O3 và O4) làm tăng đáng kể khả năng chống oxy hóa (thể hiện qua hoạt tính cao hơn của superoxide dismutase toàn phần, superoxide dismutase đồng kẽm, catalase, glutathione peroxidase và tổng khả năng chống oxy hóa, nồng độ malondialdehyde trong huyết tương thấp hơn, và biểu hiện gen điều hòa tăng của superoxide dismutase, superoxide dismutase đồng kẽm, catalase và glutathione peroxidase ở gan tụy). Đồng hữu cơ (SO, O₂, O₃ và O₄) tăng cường đáp ứng miễn dịch (thể hiện qua số lượng lớn hơn tổng số tế bào máu, hoạt tính cao hơn của phosphatase acid, phosphatase kiềm, phenoloxidase, hemocyanin và lysozyme trong huyết tương, và biểu hiện gen cao hơn của phosphatase kiềm, lysozyme và hemocyanin trong gan tụy). Đồng vô cơ (Khẩu phần S) cũng có tác động tích cực đến tôm thẻ chân trắng so với khẩu phần ăn C, nhưng các khẩu phần SO, O2, O3 và O4 cho kết quả tốt hơn, trong đó khẩu phần O2 dường như là tốt nhất. Kết luận, đồng hữu cơ có lợi hơn cho sức khỏe tôm so với đồng sunfat.

1. Giới thiệu

Đồng là một nguyên tố vi lượng thiết yếu quan trọng đối với sự sống. Đồng đóng vai trò là đồng yếu tố hoặc thành phần của các enzyme khác nhau tham gia vào nhiều chức năng sinh lý quan trọng, chẳng hạn như cytochrome c oxidase (sản xuất ATP), ferroxidase (duy trì cân bằng chuyển hóa sắt), tyrosine oxidase (xúc tác tổng hợp melanin từ tyrosine), lysyl oxidase (tổng hợp collagen) và superoxide dismutase đồng kẽm (Cu/Zn SOD) (các phản ứng chống oxy hóa) [[1], [2], [3]]. Đồng cũng là một thành phần thiết yếu của hemocyanin [[4]], chất chịu trách nhiệm vận chuyển oxy ở động vật giáp xác [[5]]. Thức ăn là nguồn cung cấp đồng chính cho động vật. Đồng sunfat là một loại khoáng vô cơ phổ biến trong thức ăn [[6],[7]]. Vật liệu thực vật được sử dụng rộng rãi để giảm hàm lượng bột cá trong nuôi trồng thủy sản [[8]]. Tuy nhiên, thành phần từ thực vật có chứa axit phytic, có thể ảnh hưởng đến sinh khả dụng của đồng vô cơ trong khẩu phần ăn [[9]]. Mặc dù tác động của axit phytic đối với sự hấp thu đồng ít quan trọng hơn so với các nguyên tố khác như kẽm và sắt [[10]], các nghiên cứu đã chỉ ra rằng axit phytic làm giảm sự giữ lại đồng ở chuột [[11], [12], [13]]. Điều này dẫn đến việc bổ sung quá mức đồng vô cơ trong thức ăn, tiềm ẩn nguy cơ gây ô nhiễm nguồn nước xung quanh khu vực nuôi trồng thủy sản. Hơn nữa, bổ sung quá nhiều đồng có thể gây độc cho động vật thủy sản, gây ra stress oxy hóa, mất cân bằng axit-bazơ và ức chế tăng trưởng [[14]].

Khoáng chất hữu cơ mang đến các lựa chọn thay thế mới cho các khoáng chất vi lượng với khả năng sinh khả dụng tốt hơn và lợi ích tăng cường miễn dịch cho động vật [[15], [16], [17]]. Đồng hữu cơ, được hình thành bằng cách chelat hóa Cu²⁺ với axit amin, protein thủy phân và peptide ngắn, có thể ngăn chặn sự tương tác của đồng-axit phytic, đồng-vitamin và đồng-khoáng chất [[7],[18]]. Đã có một số nghiên cứu báo cáo lợi ích của đồng hữu cơ đối với động vật. Ở gia súc và gia cầm, so với đồng vô cơ, đồng hữu cơ cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột và giảm bài tiết đồng ở lợn thịt [[19]], và làm tăng nồng độ đồng trong gan và cải thiện chất lượng thịt ở vịt [[20]]. Trong nuôi trồng thủy sản, bổ sung đồng hữu cơ làm tăng tốc độ tăng trưởng, làm tăng sự tích lũy đồng trong mô, tăng cường khả năng chống oxy hóa và miễn dịch ở cá tầm Nga (Acipenser gueldenstaedtii ), cho thấy sinh khả dụng cao hơn so với đồng vô cơ [[21]]. Tương tự, các nghiên cứu trên cá rô phi Nile ( Oreochromis niloticus ) [[22]], cá diếc Gibel ( Carassius auratus gibelio ) [[23]] và cá chẽm Nhật Bản ( Lateolabrax japonicus ) [[24]] cũng báo cáo hiệu quả cao hơn của đồng hữu cơ so với đồng vô cơ. Hơn nữa, ở cá mú biển ( Sebastes schlegeli , Hilgendorf), so với đồng vô cơ, đồng hữu cơ đã cải thiện khả năng kháng bệnh đối với Edwardsiella tarda [[25]]. Bên cạnh đó, đồng hữu cơ có hiệu lực gấp 3-4 lần đồng vô cơ trong việc cải thiện sự tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng ( Litopenaeus vannamei Boone, 1931) bằng cách cho ăn khẩu phần bán tinh chế có chứa axit phytic [[26]]. Các nghiên cứu trong khẩu phần ăn thương mại cũng chứng minh tác động tích cực của đồng hữu cơ đối với hiệu suất tăng trưởng và hệ vi sinh vật đường ruột của tôm thẻ chân trắng [[27]].

Tôm thẻ chân trắng là một loài thủy sản quan trọng trong nuôi trồng thủy sản toàn cầu, đóng góp 51,7% sản lượng giáp xác vào năm 2020 [[28]], và có giá trị kinh tế lớn do khả năng thích nghi tốt, tốc độ tăng trưởng nhanh và giá trị dinh dưỡng cao [[29]]. Tuy nhiên, các yếu tố sinh học (vi khuẩn, ký sinh trùng và virus) và phi sinh học (chẳng hạn như độ mặn, kim loại nặng và nhiệt độ thấp) đã là những rào cản đối với sự phát triển của nghề nuôi tôm [[30],[31]]. Tôm không có khả năng điều chỉnh nhiệt độ cơ thể, và do đó chúng nhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ [[32]]. Nhiệt độ thấp có thể gây ra nhiều rối loạn chuyển hóa và thậm chí tử vong ở tôm [[33]]. Thông tin về ảnh hưởng của đồng hữu cơ đến khả năng chịu nhiệt độ thấp và đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng còn hạn chế. Do đó, nghiên cứu này nhằm mục đích kiểm tra tác động của các nguồn và mức độ đồng khác nhau trong khẩu phần ăn đến sự tăng trưởng, các chỉ tiêu huyết học, cân bằng nội môi đồng, khả năng chịu nhiệt độ thấp, khả năng chống oxy hóa và đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Khẩu phần thí nghiệm và thử nghiệm cho ăn

Bảy khẩu phần đẳng lipid và đẳng nitơ với các nguồn và mức độ đồng khác nhau được tạo ra: C, không bổ sung đồng; S, 30 mg/kg đồng từ CuSO₄·5H₂O; SO, 15 mg/kg đồng từ CuSO₄·5H₂O và 7,5 mg/kg đồng từ Cu-proteinate; O1, O2, O3 và O4, lần lượt là 10, 20, 30 và 40 mg/kg đồng từ Cu-proteinate. Công thức được trình bày trong Bảng 1. Việc sản xuất thức ăn được thực hiện theo phương pháp của nghiên cứu trước đây [[16]], tóm lại, tất cả các thành phần rắn được nghiền và rây qua lưới 80 mesh (0,2 mm). Sau đó, các thành phần được trộn đều và ép viên (kích thước hạt < 2 mm). Sau đó, thức ăn được sấy khô trong lò ở 55°C đến trọng lượng không đổi, và sau đó được bảo quản ở -20°C trước khi sử dụng.

Bảng 1. Thành phần và công thức của các khẩu phần thí nghiệm

(Bảng này liệt kê chi tiết tỷ lệ % từng nguyên liệu trong từng khẩu phần ăn (C, S, SO, O1, O2, O3, O4) và phân tích thành phần hóa học, khoáng chất)

Nguyên liệu (%)	Khẩu phần
	C	S	SO	O1	O2	O3	O4
Peanut meal: Bột đậu phộng	22	22	22	22	22	22	22
Flour: Bột mì	22	22	22	22	22	22	22
Soybean meal: Bột đậu nành	21	21	21	21	21	21	21
Cottonseed meal: Bột hạt bông	8.5	8.5	8.5	8.5	8.5	8.5	8.5
Fish meal: Bột cá	7	7	7	7	7	7	7
Blood cells meal: Bột huyết cầu	4	4	4	4	4	4	4
Shrimp meal: Bột tôm	4	4	4	4	4	4	4
Chicken meal: Bột thịt gà	2	2	2	2	2	2	2
Fish oil: Dầu cá	2	2	2	2	2	2	2
Phospholipid: Phospholipid	1	1	1	1	1	1	1
Squid paste: Bột mực	1	1	1	1	1	1	1
Monocalcium phosphate: Monocalcium phosphate	1	1	1	1	1	1	1
Unite bran: Cám gạo (Unite bran có thể là tên thương hiệu của một loại cám gạo cụ thể)	3.59	3.578	3.5765	3.58	3.57	3.56	3.55
Vitamin mix: Premix Vitamin	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
Mineral mix: Premix Khoáng	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Choline chloride: Choline chloride	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
Y₂O₃: Yttri oxit (Y₂O₃) - thường được dùng làm chất đánh dấu	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
CuSO₄·5H₂O: Đồng sunfat ngậm 5 nước	–	0.012	0.006	–	–	–	–
Bioplex Cu: Đồng hữu cơ (Bioplex® Cu - một dạng đồng chelate hữu cơ thương mại)	–	–	0.0075	0.01	0.02	0.03	0.04
Thành phần hóa học (% vật chất khô)
Crude protein: Protein thô	43.51	43.51	43.69	43.96	44.52	43.87	43.88
Crude lipid: Lipid thô	4.33	4.62	4.23	5.43	4.77	4.12	4.35
Ash: Tro	9.16	9.08	9.05	9.05	9.15	9.17	9.1
Phân tích khoáng chất (mg/kg)
Cu (formulated value): Đồng (giá trị theo công thức)	0	30	22.5	10	20	30	40
Cu (analyzed value): Đồng (giá trị phân tích thực tế)	14.29	43.99	38.08	29.01	39.54	54.03	66.61

2.2. Thử nghiệm cho ăn

Tôm thẻ chân trắng được mua từ Công ty TNHH Nuôi trồng Thủy sản Rizhao Tengyun. Thử nghiệm cho ăn được tiến hành tại địa phương. Tôm được cho ăn khẩu phần S trong 7 ngày để thích nghi với môi trường nuôi. Sau đó, những con tôm có kích thước tương tự (5,30 ± 0,04 g) được chọn và phân bổ vào 21 bể (200 L). Mỗi bể chứa 40 con tôm và mỗi nhóm có 3 bể lặp lại. Thử nghiệm cho ăn được tiến hành theo nghiên cứu trước đây với một số sửa đổi [[16]]. Tóm lại, tôm được cho ăn 4 lần mỗi ngày (05:30, 11:00, 17:00 và 23:00). Lượng cho ăn hàng ngày là 4% trọng lượng cơ thể và được điều chỉnh theo mức tiêu thụ. Nước biển được thay một nửa mỗi ngày một lần. Ngoài ra, trong quá trình thử nghiệm cho ăn, chất lượng nước được kiểm tra hai lần một tuần và các thông số như sau: nhiệt độ 24,6 ± 0,6°C; oxy hòa tan >7 mg/L; độ mặn 18‰; pH 8,3 ± 0,1; nitrate <10 mg/L; nitrite 0,03 ± 0,02 mg/L; amoniac <0,02 mg/L, đồng <0,01 mg/L.

2.3. Thu thập mẫu

Việc thu thập mẫu được thực hiện theo nghiên cứu trước đây với một số sửa đổi [[16]]. Tóm lại, tôm được nhịn ăn trong 24 giờ sau 8 tuần cho ăn, sau đó chiều dài và trọng lượng của mỗi con tôm được đo. Sau đó, 12 con tôm được chọn từ mỗi bể. Khoảng 0,5 mL hemolymph (dịch máu) được thu thập từ mỗi con tôm và trộn ngay với chất chống đông (450 mmol/L NaCl, 10 mmol/L HEPES, 10 mmol/L EDTA-Na₂, 10 mmol/L KCl, pH 7,3, tỷ lệ 1 hemolymph : 1,5 chất chống đông) [[34]]. Sau đó, 30 μL hemolymph được lấy để đếm tổng số tế bào máu. Phần còn lại được ly tâm ở 4°C trong 10 phút ở 500 g/phút. Huyết tương được thu thập và bảo quản ở -80°C. Gan tụy của 6 con tôm trong mỗi bể được lấy ra và làm đông trong nitơ lỏng, sau đó chuyển vào ống nghiệm vô trùng không có RNase và bảo quản ở -80°C. Cơ của 2 con tôm từ mỗi bể được thu thập và bảo quản ở -20°C.

2.4. Tính toán hiệu suất tăng trưởng và số lượng tế bào máu

Các phương trình sau đây được sử dụng:

(1) Tỷ lệ tăng trọng (WGR, %) = (Trọng lượng cuối - Trọng lượng đầu) / Trọng lượng đầu × 100

(2) Tốc độ tăng trưởng đặc biệt (SGR, %/ngày) = (Ln(Trọng lượng cuối) - Ln(Trọng lượng đầu)) / số ngày × 100

(3) Lượng thức ăn ăn vào (FI, %/ngày) = Lượng thức ăn ăn vào / ((Trọng lượng đầu + Trọng lượng cuối)/2 × số ngày) × 100

(4) Hiệu quả sử dụng thức ăn (FE) = (Trọng lượng cuối - Trọng lượng đầu) / Lượng thức ăn ăn vào

(5) Hệ số điều kiện (CF, 100 g/cm³) = (Trọng lượng cơ thể / Chiều dài cơ thể³) × 100

Tổng số tế bào máu được đếm dưới kính hiển vi (N-300 M, Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd., Ningbo, Trung Quốc). Số lượng tế bào máu được tính bằng phương trình sau:

(6) Số lượng tế bào máu (tế bào/mL) = (A × hệ số pha loãng B × 10⁴) / 5

A là tổng số tế bào máu đếm được trong 5 ô vuông trung bình. B là tỷ lệ pha loãng.

2.5. Phân tích hóa học thức ăn và toàn con tôm

Thành phần hóa học của thức ăn và tôm được phân tích theo giao thức của AOAC [[35]]. Vật chất khô được đo bằng cách sấy mẫu đến trọng lượng không đổi ở 105°C, phương pháp Kjeldahl được sử dụng để xác định hàm lượng protein thô, phương pháp Soxhlet được sử dụng để xác định lipid thô; phương pháp nung được sử dụng để xác định hàm lượng tro bằng lò nung ở 550°C.

Hàm lượng ẩm và tro được đo bằng các phương trình sau:

(7) Hàm lượng ẩm (%) = (Khối lượng ướt - Khối lượng khô) / Khối lượng ướt × 100

(8) Hàm lượng tro (%) = (Khối lượng tro sau khi nung / Khối lượng khô) × 100

2.6. Stress nhiệt độ thấp

Đối với stress nhiệt độ thấp, tôm được nhịn ăn trong 24 giờ sau 8 tuần cho ăn, 10 con tôm có kích thước tương tự và sức sống tốt được chọn ngẫu nhiên từ mỗi bể. Thử nghiệm thách thức được tiến hành trong 21 hộp xốp. Trong mỗi hộp, thêm khoảng 10 L nước biển. Các túi đá được sử dụng để hạ nhiệt độ nước cho đến khi đạt 10°C. Các túi đá được thay đổi mỗi 12 giờ để duy trì nhiệt độ nước. Tỷ lệ chết được ghi lại trong 36 giờ. Trong thử nghiệm thách thức, tôm không được cho ăn.

2.7. Thành phần huyết tương và hoạt động enzyme

Các bộ kit thử nghiệm thương mại được sử dụng để xác định nồng độ glucose (Glu, S0201S), malondialdehyde (MDA, S0131 M), và tổng protein (TP, P0006) và hoạt động của phosphatase acid (ACP, P0326), phosphatase kiềm (AKP, P0321S), catalase (CAT, S0051), Cu/Zn SOD (S0103) và superoxide dismutase toàn phần (T-SOD S0101 M) của huyết tương (Beyotime Biotechnology). Các bộ kit xét nghiệm ELISA được sử dụng để xác định hoạt động của hemocyanin (Hemo, F952236-A) và lysozyme (LZM, F5103) (Shanghai FANKEL Industrial Co., Ltd. Shanghai, Trung Quốc). Các bộ kit thử nghiệm thương mại được sử dụng để xác định nồng độ albumin (ALB, A028-1-1), đồng (Cu, E010-1-1), cholesterol toàn phần (T-CHO, A111-2-1) và triglyceride (TG, A110-2-1), và hoạt động của glutathione peroxidase (Gpx, A005-1), phenoloxidase (PO, H247), và tổng khả năng chống oxy hóa (T-AOC, A015-2-1) của huyết tương (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).

2.8. Tách chiết RNA và qPCR

Bộ Kit MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit được sử dụng để tách chiết tổng RNA từ gan tụy (19221ES50; Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai, Trung Quốc). Gel agarose 1,2% (w/v) được sử dụng để xác định tính toàn vẹn của RNA đã tách chiết. Máy quang phổ NanoDrop™ 2000 (Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA) được sử dụng để đánh giá nồng độ và chất lượng của RNA. Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR được sử dụng để phiên mã ngược RNA (11141ES60; Yeasen, Shanghai, Trung Quốc).

Phản ứng qPCR được thực hiện trong tổng thể tích 20 μL: khuôn cDNA, 1 μL; mồi xuôi 10 μM, 0,4 μL; mồi ngược 10 μM, 0,4 μL; RNase-free ddH₂O, 8,2 μL; SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit (AG11701, Accurate Biotechnology (Hunan) Co., Ltd., Hunan, Trung Quốc), 10 μL. Hơn nữa, một mẫu đối chứng không khuôn (NTC) được thiết lập để xác định sự nhiễm bẩn axit nucleic ngoại lai. Chương trình qPCR như sau: 95°C trong 30 giây, 40 chu kỳ gồm 5 giây ở 95°C và 30 giây ở 60°C. Phân tích qPCR được thực hiện trên máy PCR thời gian thực (CFX96, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Các mồi được thiết kế bằng công cụ Primer-BLAST của National Center for Biotechnology Information và được tổng hợp bởi Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd (Bảng 2). β-Actin được chọn làm gen tham chiếu dựa trên nghiên cứu trước đây [[16]]. Mức độ biểu hiện gen tương đối được tính bằng phương pháp 2^−ΔΔCq^ [[36]].

Bảng 2. Trình tự mồi và thông tin khuếch đại của qPCR

(Bảng này liệt kê trình tự mồi, nhiệt độ annealing, chiều dài sản phẩm, hiệu suất khuếch đại và số truy cập GenBank cho từng gen: ACP, AKP, ATP7b like, CAT, Cu/Zn SOD, Gpx, Hemo, LZM, MT, ProPO, SOD, β-actin

Genes	Trình tự Primer (5′-3′)	Tm (°C)	Độ dài	Amplification efficiency	GenBank Accession no.
ACP	F: AAGCCTGAAGTTCGTGCTGA	60	97	1.034	KR676449.1
	R: TGACTCTGGTGCAGTCATCG
AKP	F: GCGAGACGACAACGGATTC	60	170	1.114	KR534873.1
	R: CAGCGGTGACGATGATAAGAG
ATP7b like	F: TGACCCATCAGTCTTGAGTGC	60	135	0.941	XM_027356375.1
	R: TCATGGCTGGCCTTAGGAAC
CAT	F: TAAGGGAGCAGGTGCCTTTG	60	157	1.002	AY518322.1
	R: ATCCCTGGCAGTGTCAGTTG
Cu/Zn SOD	F: ACAATCCGTATATGCGCCCC	60	145	1.016	MF318886.1
	R: ACCGTACGAGGTCCCACTAA
Gpx	F: GGCACCAGGAGAACACTACC	60	73	1.026	AY973252.2
	R: TCGAAGTTGTTCCCAGGACG
Hemo	F: AGACTGGGCATCCTTTGTCG	60	135	1.063	MK896907.1
	R: TCATAGAGGGGAGGGAGCAC
LZM	F: GGTGCGCCGAGACTATCC	60	85	1.069	AY170126.2
	R: TTGCTGTTGTAAGCCACCCA
MT	F: CCCATCCAAGGAGGAGTGTG	60	88	1.034	JN707684.1
	R: AGCAGCAGAAGACAGTCGAG
ProPO	F: GAACTCCATTCCGTCCGTCTG	60	123	1.048	AY723296.1
	R: GGCTTCGCTCTGGTTAGGAT
SOD	F: ACGTAAGCGCAATGAATGCC	60	93	1.087	AB108065.1
	R: GAAGCCATGTTGGGTCCAGA
β-actin	F: CGAGAGGAAGCAGCACGTA	60	164	1.01	AF300705.2
	R: GACGATGGAGGGGAACACAG

Các chữ viết tắt:

ACP: Phosphatase acid, AKP: Phosphatase kiềm, ATP7b like: ATPase vận chuyển đồng dạng 2 (ATP7b like), CAT: Catalase, Cu/Zn SOD: Superoxide dismutase đồng/kẽm, Gpx: Glutathione peroxidase, Hemo: Hemocyanin, LZM: Lysozyme, MT: Metallothionein, ProPO: Pro-phenoloxidase, SOD: Superoxide dismutase

2.9. Phân tích tích lũy đồng

Nồng độ đồng trong thức ăn và cơ được phân tích bằng quang phổ phát xạ quang học plasma cảm ứng (ICP-OES). Tóm lại, cân khoảng 0,2 g thức ăn khô và cơ khô và chuyển vào ống tiêu hóa vi sóng. Mười mL HNO₃ (AR, 65–70%) được thêm vào mỗi ống. Sau khi phân hủy, mẫu được hòa tan hoàn toàn trong nước siêu tinh khiết và định mức thành 25 mL. Tất cả các mẫu được phân tích đồng bằng máy ICP-OES (Avio 200, PerkinElmer, MA, USA).

2.10. Phân tích thống kê

Kết quả được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA). Kiểm định phạm vi đa so sánh của Tukey được sử dụng để so sánh nhiều giá trị trung bình nhóm. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa khi P < 0,05. Dữ liệu được phân tích bằng SPSS 22.0 (IBM SPSS Corporation, Chicago, IL, USA).

3. Kết quả

3.1. Hiệu suất tăng trưởng và thành phần hóa học

Không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy về FBW (trọng lượng cuối), WGR, SGR, FI, FE hoặc CF, protein thô, độ ẩm hoặc lipid thô của tôm giữa tất cả các nhóm (Bảng 3) (P > 0,05).

Bảng 3. Ảnh hưởng của đồng hữu cơ và vô cơ đến hiệu suất tăng trưởng và thành phần hóa học của tôm thẻ chân trắng

(Bảng này trình bày các số liệu về trọng lượng đầu/cuối, WGR, SGR, FI, FE, CF, độ ẩm, protein thô, lipid thô cho các nhóm C, S, SO, O1, O2, O3, O4. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê)

Khẩu phần	C	S	SO	O1	O2	O3	O4
IBW (g)	5.27 ± 0.01	5.33 ± 0.02	5.32 ± 0.02	5.30 ± 0.04	5.30 ± 0.01	5.27 ± 0.02	5.29 ± 0.01
FBW (g)	10.41 ± 0.21	10.75 ± 0.35	9.73 ± 0.52	10.56 ± 0.25	9.74 ± 0.22	9.99 ± 0.61	9.82 ± 0.71
WGR (%)	97.5 ± 4.2	101.9 ± 7.3	82.9 ± 9.2	99.3 ± 4.1	83.9 ± 4.0	89.8 ± 11.6	85.6 ± 13.3
SGR (%/day)	1.21 ± 0.04	1.25 ± 0.07	1.07 ± 0.09	1.23 ± 0.04	1.09 ± 0.04	1.14 ± 0.11	1.10 ± 0.12
FI (%/day)	2.64 ± 0.19	2.66 ± 0.22	2.62 ± 0.19	2.66 ± 0.11	2.85 ± 0.15	2.50 ± 0.15	2.75 ± 0.12
FE	0.503 ± 0.023	0.517 ± 0.058	0.460 ± 0.071	0.514 ± 0.034	0.429 ± 0.034	0.502 ± 0.072	0.432 ± 0.066
CF (100 g/cm3)	0.874 ± 0.031	0.850 ± 0.009	0.843 ± 0.005	0.856 ± 0.008	0.875 ± 0.017	0.878 ± 0.009	0.880 ± 0.008
Thành phần hóa học (khối lượng ướt)
Độ ẩm (%)	78.59 ± 0.41	79.31 ± 0.94	77.82 ± 1.24	77.70 ± 0.71	78.99 ± 0.55	78.03 ± 0.57	78.45 ± 0.55
Đạm thô(%)	15.66 ± 0.06	15.79 ± 0.14	16.35 ± 0.24	16.33 ± 0.29	16.03 ± 0.40	16.39 ± 0.09	15.80 ± 0.06
Béo thô (%)	1.02 ± 0.05	1.21 ± 0.12	1.10 ± 0.02	1.11 ± 0.06	1.00 ± 0.04	1.01 ± 0.04	1.08 ± 0.03

3.2. Các chỉ tiêu huyết học

Trong huyết tương, như thể hiện trong Bảng 4, các nhóm S, O2 và O4 có nồng độ TP cao hơn đáng kể so với các nhóm C, SO và O1 (P < 0,05). Nhóm O3 có nồng độ TP cao nhất (P < 0,05). Các nhóm O2, O3 và O4 có nồng độ ALB cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S, SO và O1 (P < 0,05). Nồng độ Glu của các nhóm S, O2 và O3 cao hơn đáng kể so với các nhóm C và O1 (P < 0,05). Nồng độ Glu của nhóm O3 cao hơn đáng kể so với nhóm SO và O4 (P < 0,05). Các nhóm S, O1 và O2 có nồng độ TG cao hơn đáng kể so với các nhóm SO, O3 và O4 và thấp hơn đáng kể so với nhóm C (P < 0,05). Các nhóm O1 và O2 có nồng độ T-CHO cao hơn đáng kể so với các nhóm SO, O3 và O4 và thấp hơn đáng kể so với nhóm C (P < 0,05).

Bảng 4. Ảnh hưởng của đồng hữu cơ và vô cơ đến các thành phần sinh hóa trong huyết tương tôm

(Bảng này trình bày số liệu về TP, ALB, Glu, TG, T-CHO trong huyết tương cho các nhóm C, S, SO, O1, O2, O3, O4. Các chữ cái viết trên khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê).

Khẩu phần	C	S	SO	O1	O2	O3	O4
TP (g/L)	89.91 ± 2.64a	140.88 ± 1.92c	109.85 ± 4.15b	106.09 ± 4.77ab	143.99 ± 6.26c	167.17 ± 0.52d	135.14 ± 4.47c
ALB (g/L)	19.02 ± 0.53a	18.22 ± 0.78a	20.19 ± 1.12a	20.81 ± 0.81a	31.68 ± 1.71b	32.66 ± 1.76b	30.47 ± 2.22b
Glu (mmol/L)	0.561 ± 0.011a	0.726 ± 0.024bc	0.650 ± 0.020ab	0.606 ± 0.035a	0.736 ± 0.034bc	0.839 ± 0.010c	0.665 ± 0.034ab
TG (mmol/L)	0.886 ± 0.038c	0.611 ± 0.057b	0.379 ± 0.010a	0.620 ± 0.025b	0.583 ± 0.027b	0.315 ± 0.009a	0.403 ± 0.055a
T-CHO (mmol/L)	1.183 ± 0.030d	0.608 ± 0.035a	0.791 ± 0.020bc	0.945 ± 0.043c	0.860 ± 0.046c	0.547 ± 0.014a	0.673 ± 0.064ab

3.3. Tích lũy và vận chuyển đồng

Trong Hình 1A, các nhóm O2, O3 và O4 có nồng độ đồng trong cơ cao hơn đáng kể so với các nhóm C và O1 (P < 0,05). Nhóm C có nồng độ đồng trong huyết tương thấp nhất (P < 0,05). Nhóm O2 có nồng độ đồng trong huyết tương cao hơn đáng kể so với nhóm S (P < 0,05). Các nhóm O2 và O3 có nồng độ đồng trong huyết tương cao hơn đáng kể so với các nhóm SO, O1 và O4 (P < 0,05).

Trong gan tụy (Hình 1B), biểu hiện của MT ở tôm được cho ăn các khẩu phần SO, O1, O2, O3 và O4 được điều hòa tăng đáng kể so với khẩu phần C (P < 0,05). Biểu hiện của MT ở nhóm O3 cao hơn đáng kể so với nhóm S (P < 0,05). Biểu hiện của ATP7b like ở các nhóm SO, O2, O3 và O4 cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Biểu hiện của ATP7b like ở nhóm O1 cao hơn đáng kể so với nhóm C (P < 0,05).

Hình 1. Ảnh hưởng của đồng hữu cơ và vô cơ đến sự tích lũy đồng trong cơ và huyết tương (A) và biểu hiện gen liên quan đến vận chuyển đồng trong gan tụy của tôm thẻ chân trắng (B). Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± S.E. của 3 bể lặp lại. Các chữ cái viết trên khác nhau chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05).

3.4. Stress nhiệt độ thấp

Tôm được cho ăn bổ sung đồng trong khẩu phần cho thấy tỷ lệ chết thấp hơn sau 36 giờ stress nhiệt độ thấp. Tỷ lệ chết của tôm được cho ăn các khẩu phần S, SO, O1, O2, O3 và O4 lần lượt thấp hơn 28,57%, 38,10%, 33,33%, 52,38%, 47,62% và 28,57% so với khẩu phần C. Các nhóm O2 và O3 có tỷ lệ chết thấp hơn đáng kể so với nhóm C (Hình 2) (P < 0,05).

Hình 2. Ảnh hưởng của đồng hữu cơ và vô cơ đến tỷ lệ chết của tôm thẻ chân trắng sau 36 giờ stress nhiệt độ thấp. Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± S.E. của 3 bể lặp lại. Các chữ cái viết trên khác nhau chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05).

3.5. Khả năng chống oxy hóa

Trong huyết tương (Hình 3A), các nhóm SO, O2, O3 và O4 có hoạt động T-SOD cao hơn đáng kể so với các nhóm C và S (P < 0,05). Các nhóm SO, O2, O3 và O4 có hoạt động Cu/Zn SOD cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Các nhóm SO, O2, O3 và O4 có hoạt động CAT cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Các nhóm SO, O2, O3 và O4 có hoạt động Gpx cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Các nhóm SO, O2, O3 và O4 có hoạt động T-AOC cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Các nhóm S, SO, O2, O3 và O4 có nồng độ MDA thấp hơn đáng kể so với nhóm C (P < 0,05). Nồng độ MDA của nhóm O1 thấp hơn đáng kể so với nhóm C (P < 0,05).

Trong gan tụy (Hình 3C), biểu hiện của SOD ở các nhóm SO, O2, O3 và O4 cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Biểu hiện của Cu/Zn SOD ở các nhóm SO, O2, O3 và O4 cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Biểu hiện của CAT ở các nhóm SO, O2, O3 và O4 cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Biểu hiện của Gpx ở các nhóm SO, O2, O3 và O4 cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05).

Hình 3. Ảnh hưởng của đồng hữu cơ và vô cơ đến biểu hiện gen liên quan đến chống oxy hóa trong gan tụy của tôm thẻ chân trắng. Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± S.E. của 3 bể lặp lại. Các chữ cái viết trên khác nhau chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05).

3.6. Đáp ứng miễn dịch

Trong huyết tương (Hình 4A), các nhóm SO, O2, O3 và O4 có số lượng THC cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Các nhóm SO, O2, O3 và O4 có hoạt động ACP cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Các nhóm SO, O2, O3 và O4 có hoạt động AKP cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Các nhóm SO, O2, O3 và O4 có hoạt động PO cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Các nhóm SO, O2, O3 và O4 có hoạt động Hemo cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Các nhóm SO, O2, O3 và O4 có hoạt động LZM cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05).

Trong gan tụy (Hình 4C), biểu hiện của ACP ở các nhóm SO, O2, O3 và O4 cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Biểu hiện của AKP ở các nhóm SO, O2, O3 và O4 cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Biểu hiện của LZM ở các nhóm SO, O2, O3 và O4 cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Biểu hiện của Hemo ở các nhóm SO, O2, O3 và O4 cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05). Biểu hiện của ProPO ở các nhóm SO, O2, O3 và O4 cao hơn đáng kể so với các nhóm C, S và O1 (P < 0,05).

Hình 4. Ảnh hưởng của đồng hữu cơ và vô cơ đến biểu hiện gen liên quan đến miễn dịch trong gan tụy của tôm thẻ chân trắng. Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± S.E. của 3 bể lặp lại. Các chữ cái viết trên khác nhau chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05).

4. Thảo luận

4.1. Hiệu suất tăng trưởng và thành phần hóa học

Trong nghiên cứu này, không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy về hiệu suất tăng trưởng và thành phần hóa học của tôm giữa các nhóm. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây trên cá tầm Nga [[21]], cá chẽm Nhật Bản [[24]] và cá rô phi [[22]], nơi không có sự khác biệt đáng kể về tăng trưởng được quan sát thấy giữa các nguồn đồng khác nhau. Tuy nhiên, một nghiên cứu trước đây trên tôm thẻ chân trắng cho thấy rằng đồng hữu cơ có hiệu quả gấp 3-4 lần đồng vô cơ trong việc cải thiện tăng trưởng [[26]]. Sự khác biệt này có thể là do sự khác biệt về công thức khẩu phần. Nghiên cứu trước đây sử dụng khẩu phần bán tinh chế có chứa axit phytic, trong khi nghiên cứu hiện tại sử dụng khẩu phần thực tế hơn. Axit phytic có thể tạo phức với đồng vô cơ, làm giảm sinh khả dụng của nó [[9],[37]]. Do đó, trong khẩu phần không có axit phytic, sinh khả dụng của đồng vô cơ có thể được cải thiện, dẫn đến không có sự khác biệt về tăng trưởng giữa các nguồn đồng. Hơn nữa, tôm trong nghiên cứu này có thể đã nhận đủ đồng từ các thành phần khẩu phần cơ bản, do đó, việc bổ sung thêm đồng không ảnh hưởng đến tăng trưởng.

4.2. Các chỉ tiêu huyết học

Các chỉ tiêu huyết học phản ánh tình trạng sức khỏe và dinh dưỡng của động vật [[38]]. Trong nghiên cứu này, đồng hữu cơ (đặc biệt là O2 và O3) làm tăng nồng độ TP, ALB và Glu trong huyết tương. TP và ALB là những chỉ số quan trọng của tình trạng protein và chức năng gan [[39]]. Glu là nguồn năng lượng chính cho quá trình trao đổi chất [[40]]. Kết quả này cho thấy đồng hữu cơ có thể cải thiện tình trạng protein và cung cấp năng lượng cho tôm. Đồng thời, đồng hữu cơ (đặc biệt là O3 và O4) làm giảm nồng độ TG và T-CHO trong huyết tương. TG và T-CHO là những chỉ số của quá trình chuyển hóa lipid [[41]]. Kết quả này cho thấy đồng hữu cơ có thể cải thiện quá trình chuyển hóa lipid và giảm nguy cơ gan nhiễm mỡ.

4.3. Tích lũy và vận chuyển đồng

Kết quả của nghiên cứu này cho thấy đồng hữu cơ (đặc biệt là O2 và O3) làm tăng nồng độ đồng trong cơ và huyết tương. Điều này cho thấy đồng hữu cơ có sinh khả dụng cao hơn đồng vô cơ. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây trên cá tầm Nga [[21]] và cá rô phi [[22]], nơi đồng hữu cơ làm tăng sự tích lũy đồng trong mô.

Hơn nữa, đồng hữu cơ (đặc biệt là SO, O2, O3 và O4) làm tăng biểu hiện của MT và ATP7b like trong gan tụy. MT là một protein liên kết kim loại tham gia vào cân bằng nội môi đồng và giải độc [[42]]. ATP7b là một ATPase vận chuyển đồng tham gia vào bài tiết đồng [[43]]. Sự điều hòa tăng của các gen này cho thấy đồng hữu cơ có thể thúc đẩy sự hấp thu, vận chuyển và bài tiết đồng, do đó duy trì cân bằng nội môi đồng.

4.4. Stress nhiệt độ thấp

Nhiệt độ thấp là một yếu tố stress môi trường quan trọng đối với tôm [[33]]. Trong nghiên cứu này, tôm được cho ăn đồng hữu cơ (đặc biệt là O2 và O3) có tỷ lệ chết thấp hơn đáng kể sau stress nhiệt độ thấp. Điều này cho thấy đồng hữu cơ có thể tăng cường khả năng chịu lạnh của tôm. Cơ chế có thể liên quan đến việc cải thiện khả năng chống oxy hóa và miễn dịch, như được thảo luận dưới đây.

4.5. Khả năng chống oxy hóa

Stress oxy hóa là kết quả của sự mất cân bằng giữa các loại oxy phản ứng (ROS) và khả năng chống oxy hóa [[44]]. Trong nghiên cứu này, đồng hữu cơ (SO, O2, O3 và O4) làm tăng hoạt động của T-SOD, Cu/Zn SOD, CAT, Gpx và T-AOC trong huyết tương và giảm nồng độ MDA. SOD, CAT và Gpx là các enzyme chống oxy hóa quan trọng tham gia vào việc loại bỏ ROS [[45]]. T-AOC phản ánh tổng khả năng chống oxy hóa [[46]]. MDA là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid và là một chỉ số của stress oxy hóa [[47]].

Hơn nữa, đồng hữu cơ (SO, O2, O3 và O4) làm tăng biểu hiện của SOD, Cu/Zn SOD, CAT và Gpx trong gan tụy. Kết quả này cho thấy đồng hữu cơ có thể tăng cường khả năng chống oxy hóa bằng cách điều hòa tăng biểu hiện gen và hoạt động của các enzyme chống oxy hóa.

4.6. Đáp ứng miễn dịch

Hệ thống miễn dịch của động vật giáp xác bao gồm miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch [[48]]. Trong nghiên cứu này, đồng hữu cơ (SO, O2, O3 và O4) làm tăng số lượng THC và hoạt động của ACP, AKP, PO, Hemo và LZM trong huyết tương. THC là chỉ số của miễn dịch tế bào [[49]]. ACP và AKP là các enzyme thủy phân tham gia vào quá trình thực bào [[50]]. PO là một enzyme quan trọng trong hệ thống prophenoloxidase, một thành phần của miễn dịch bẩm sinh [[51]]. Hemo không chỉ là protein vận chuyển oxy mà còn có hoạt tính phenoloxidase và kháng khuẩn [[52]]. LZM là một enzyme kháng khuẩn phân giải thành tế bào vi khuẩn [[53]].

Hơn nữa, đồng hữu cơ (SO, O2, O3 và O4) làm tăng biểu hiện của ACP, AKP, LZM, Hemo và ProPO trong gan tụy. Kết quả này cho thấy đồng hữu cơ có thể tăng cường cả miễn dịch tế bào và thể dịch bằng cách điều hòa tăng biểu hiện gen và hoạt động của các phân tử miễn dịch.

5. Kết luận

Tóm lại, kết quả của nghiên cứu này chứng minh rằng đồng hữu cơ có lợi hơn đồng vô cơ cho sức khỏe của tôm thẻ chân trắng. Đồng hữu cơ thúc đẩy tích lũy và vận chuyển đồng, tăng cường khả năng chịu lạnh, cải thiện khả năng chống oxy hóa và đáp ứng miễn dịch. Trong số các mức độ đồng hữu cơ được thử nghiệm, 20 mg/kg (O2) và 30 mg/kg (O3) cho thấy hiệu quả tốt nhất. Do đó, đồng hữu cơ được khuyến nghị sử dụng trong thức ăn cho tôm thẻ chân trắng để cải thiện sức khỏe và khả năng chống chịu stress.

Tuyên bố về đóng góp của tác giả

Jinzhu Yang: Thực hiện thí nghiệm, Phân tích dữ liệu, Viết bản thảo ban đầu.

Zhonghao Zhang: Thực hiện thí nghiệm, Phân tích dữ liệu.

Gang Lin: Phân tích dữ liệu.

Mingzhu Li: Phân tích dữ liệu.

Yanjiao Zhang: Thiết kế thí nghiệm, Giám sát, Viết bài - Xem xét và Chỉnh sửa.

Kangsen Mai: Thiết kế thí nghiệm, Giám sát, Viết bài - Xem xét và Chỉnh sửa.

Tuyên bố về cạnh tranh lợi ích

Các tác giả tuyên bố rằng họ không có bất kỳ mối quan hệ tài chính/cá nhân nào có thể được coi là cạnh tranh lợi ích tiềm tàng.

Lời cảm ơn

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Quỹ Khoa học Tự nhiên Quốc gia Trung Quốc (U21A20267) và Chương trình Nghiên cứu & Phát triển Trọng điểm Quốc gia (2022YFD2400304). Các tác giả cảm ơn các cộng tác viên trong phòng thí nghiệm vì sự hỗ trợ của họ trong quá trình thí nghiệm.