Kết quả cho thấy rằng phân tôm có thể là con đường lây nhiễm
Nghiên cứu này đánh giá tác động của độ mặn khác nhau lên tình trạng nhiễm trùng do vi bào tử trùng nội bào Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) ở tôm thẻ chân trắng trong điều kiện thực nghiệm. Kết quả cho thấy rằng phân tôm có thể là một con đường lây nhiễm EHP xảy ra ở độ mặn thấp tới 2 ppt nhưng tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng EHP cao hơn ở độ mặn 30 ppt
Bệnh Hepatopancreatic Microsporidiosis (HPM), do vi bào tử trùng nội bào Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây ra, đã được báo cáo ở một số loài tôm he, bao gồm tôm sú và tôm thẻ chân trắng. EHP đã được báo cáo ở nhiều khu vực khác nhau, bao gồm các nước châu Á như Trung Quốc, Indonesia, Malaysia, Việt Nam, Thái Lan và Ấn Độ. Gần đây, EHP cũng đã được báo cáo ở Venezuela, nằm ở bán cầu tây.
EHP gây ra các tổn thương ở các tế bào biểu mô ống gan tụy (HP), và các dấu hiệu lâm sàng chính của nó là chậm phát triển dẫn đến tăng sự thay đổi kích thước. Các sợi phân trắng nổi trên bề mặt nước ao và sự hiện diện của tôm có màu trắng ở đường tiêu hóa (GI tract) trong các ao này cũng có liên quan đến EHP. Ở giai đoạn tiến triển của bệnh, tôm bị nhiễm EHP thường có vỏ mềm, lờ đờ, lượng thức ăn ăn vào giảm, ruột giữa rỗng và tỷ lệ chết mãn tính.
Ở các quốc gia đã báo cáo về EHP, chẳng hạn như Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam và Venezuela, hoạt động nuôi tôm được thực hiện trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau, bao gồm các vùng biển ven bờ, vùng cửa sông và vùng nội địa. Ví dụ, ở một số tiểu bang ở phía đông Ấn Độ, chẳng hạn như Andhra Pradesh, các ao được đổ đầy nước giếng khoan trộn với nước cửa sông, khiến độ mặn của các ao nuôi tăng trưởng dao động trong khoảng từ 0 đến 30 ppt với độ mặn trung bình khoảng 10 ppt. Ngược lại, ở các tiểu bang nằm ở phía tây của đất nước như Gujarat, độ mặn trong nước ao có thể dao động trong khoảng từ 30 đến 44 ppt. Ở phía tây bắc Venezuela, một số trại nuôi tôm nằm quanh Hồ Maracaibo, nơi độ mặn dao động từ 2 đến 5 ppt, trong khi ở phía đông bắc Venezuela, các trại nuôi tôm nằm trong môi trường biển nơi độ mặn dao động từ 20 đến 40 ppt, và EHP đã được báo cáo ở cả hai môi trường có độ mặn cao và thấp. Ở cả hai quốc gia này, tỷ lệ mắc EHP có vẻ cao hơn ở môi trường có độ mặn cao, nhưng cho đến nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá mối quan hệ có thể có giữa độ mặn và sự hiện diện của EHP.
Thiết lập nghiên cứu
Các xét nghiệm sinh học được tiến hành tại Phòng thí nghiệm bệnh lý nuôi trồng thủy sản (UA-APL) của Đại học Arizona. Tôm thẻ chân trắng sạch bệnh (SPF) được lấy từ một nhà cung cấp thương mại ở Florida, Hoa Kỳ. Quần thể SPF đã được sàng lọc trong 2 năm qua tại UA-APL mà không có bất kỳ bệnh nào được liệt kê và không được liệt kê của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), bao gồm cả EHP.
Phân lập EHP được sử dụng trong nghiên cứu này được lấy từ quần thể tôm thẻ chân trắng có nguồn gốc từ Thái Lan. Hai thử nghiệm EHP độc lập đã được tiến hành. Trong cả hai thử nghiệm, tôm được nuôi ở 3 độ mặn khác nhau là 2 ppt, 15 ppt và 30 ppt. Đối với mỗi thử thách thực nghiệm, 6 bể 90 lít được đổ đầy nước biển nhân tạo tương ứng với 3 mức độ mặn với 2 lần lặp lại cho mỗi lần xử lý độ mặn. Nhiệt độ được điều chỉnh ở 25 °C (± 0,6) với các phép đo vào mỗi buổi sáng; pH được đo một lần một tuần với phạm vi từ 7,5–8,0.
Độ mặn được điều chỉnh bằng cách thay đổi 3 phần độ mặn mỗi giờ từ 25 ppt (độ mặn ban đầu của quần thể tôm thẻ chân trắng SPF) xuống còn 5 ppt. Để đạt được độ mặn từ 5 ppt xuống còn 2 ppt, phần độ mặn được thay đổi sau mỗi 2 giờ. Sau khi thiết lập, độ mặn được đo bằng khúc xạ kế 1 lần/tuần trong suốt thời gian thử nghiệm. 10 tôm thẻ chân trắng SPF (2,0–2,1 gam) được thả vào mỗi bể để gây nhiễm thực nghiệm. 3 bể đối chứng 90 lít được thiết lập cho mỗi độ mặn làm đối chứng âm tính.
Kết quả và thảo luận
Chúng tôi đã nghiên cứu sự phổ biến và mức độ nghiêm trọng của EHP ở 3 độ mặn: cao (30 ppt), trung bình (15 ppt) và thấp (2 ppt) trong điều kiện thử thách trong phòng thí nghiệm. Các chuỗi phân được sử dụng làm nguồn EHP trong các thử thách thực nghiệm đủ để gây bệnh cho tôm được nuôi ở các độ mặn khác nhau, như đã được xác nhận bằng mô bệnh học và PCR. Kết quả từ nghiên cứu này cung cấp một phương pháp lây nhiễm EHP mới thông qua chuỗi phân theo đường phân-miệng.
Tỷ lệ sống sót cuối cùng vào cuối thử thách EHP là cao, dao động từ 90 – 100%, ở 3 độ mặn trong mỗi 2 thử thách thử nghiệm độc lập (Bảng 1). Tỷ lệ sống sót trong các phương pháp xử lý đối chứng là 100% ở tất cả các độ mặn trong 2 thử nghiệm thử thách độc lập. Chúng tôi không quan sát thấy bất kỳ dấu hiệu lâm sàng nào ở tôm tiếp xúc với EHP ở 3 độ mặn khác nhau.
Bảng 1. Tỷ lệ sống cuối cùng ở tôm trong 2 thử thách thử nghiệm độc lập ở 3 độ mặn khác nhau. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD
Các chuỗi phân được thu thập hàng ngày từ các bể đã biết bị nhiễm EHP. Các mẫu chuỗi phân hàng ngày đều có kết quả xét nghiệm dương tính với EHP trong cả 2 thử thách. Trọng lượng trung bình của các chuỗi phân được thêm vào mỗi bể lần lượt là 1,17 ± 0,52 gam và 0,32 ± 0,24 gam đối với thử thách 1 và 2. Số lượng bản sao EHP trong các chuỗi phân được sử dụng làm chất cấy cao hơn đáng kể trong thử thách 2 (p < 0,05). Số lượng bản sao EHP trong chuỗi phân ở thử thách 1 là 1,6 × 103 ± 2,1 × 103 bản sao/ng DNA so với 1,1 × 106 ± 2,0 × 106 bản sao/ng DNA trong mẫu cấy ở thử thách 2.
Tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm trọng của EHP ở tôm mà chúng tôi đã thử nghiệm bằng cách sử dụng chuỗi phân đã được đánh giá bằng mô học H&E. Trong cả 2 thử nghiệm, chuỗi phân đều có thể gây ra bệnh ở tôm SPF. Tỷ lệ mắc EHP là 28,5% trong thử nghiệm 1 so với 50% trong thử nghiệm 2. Dữ liệu xác nhận rằng chuỗi phân là nguồn gây nhiễm EHP trong thử nghiệm.
Tỷ lệ nhiễm EHP ở độ mặn 2 ppt, 15 ppt và 30 ppt trong thử thách 1 lần lượt là 25, 33,3 và 25%. Trong thử thách 2, tỷ lệ nhiễm EHP lần lượt là 33,3, 30,0 và 87,5%. Mức độ nghiêm trọng cao hơn ở độ mặn 30 ppt trong thử nghiệm thứ 2. Trong thử thách 2, 50% quần thể bị nhiễm EHP ở độ mặn 30 ppt biểu hiện các tổn thương cấp độ G3 (trung bình đến nặng) và G4 (nặng) do nhiễm EHP. Chúng tôi tìm thấy mối liên hệ chặt chẽ giữa độ mặn và tôm bị nhiễm EHP, và tỷ lệ mắc EHP ở tôm tiếp xúc với độ mặn cao (30 ppt) cao hơn ở tôm tiếp xúc với độ mặn thấp (2 ppt và 15 ppt kết hợp). Các mức độ nghiêm trọng khác nhau trong nghiên cứu này được thể hiện trong Hình 1.

Hình 1. Nhuộm H&E (Mayer-Bennet hematoxylin và eosin-phloxine) mô gan tụy của tôm cho thấy sự hiện diện các giai đoạn khác nhau của nhiễm trùng EHP a-c: cấp độ 0; d-f: cấp độ 1; g-i: cấp độ 2; j-l: cấp độ 3; m-o: cấp độ 4 của nhiễm trùng EHP. Bào tử trưởng thành được chỉ ra bằng các ngôi sao màu xanh lam. Hình vuông màu đen cho thấy giai đoạn plasmodium thường xuyên - bất thường điển hình. Các vòng tròn màu đen cho thấy các khu vực có EHP. Hình vuông màu đỏ phác thảo các vùng được phóng đại. Các thanh tỷ lệ nằm ở phần dưới bên phải của mỗi hình
Hình 1, bảng A, B và C cho thấy các lát cắt mô của HP ở độ phóng đại thấp, trung bình và cao của tôm khỏe mạnh từ bể đối chứng mà không cho thấy bất kỳ tổn thương mô học nào của EHP hoặc bất kỳ tác nhân gây bệnh nào khác. Ngược lại, bảng D, E và F cho thấy các lát cắt mô HP hiển thị cấp độ G1 của nhiễm trùng EHP. Một vùng khu trú bên trong HP đã được quan sát thấy (Hình 1d). Ống gan tụy bị ảnh hưởng cho thấy các thể vùi tế bào chất đặc biệt trong tế bào chất của các tế bào ống biểu mô bị ảnh hưởng tương ứng với giai đoạn meront đơn nhân (Hình 1e-f). Hình 1, bảng G, H và I cho thấy cấp độ G2 của nhiễm trùng EHP (thấp đến trung bình). Sự hiện diện của nhiễm trùng EHP trong một số tế bào biểu mô ống HP bị ảnh hưởng đã được quan sát thấy. Cả giai đoạn meront và bào tử giải phóng vào đều được quan sát thấy (Hình 1i). Hình 1, bảng J, K và L cho thấy cấp độ G3 điển hình của nhiễm trùng EHP.
Tổn thương đa ổ ở tế bào biểu mô ống gan tụy đã được quan sát (Hình 1j). Ở các ống bị ảnh hưởng, sự hiện diện của cả plasmodium đa nhân không đều và bào tử trong tế bào chất của các tế bào biểu mô biểu bì đã được quan sát (Hình 1). Hình 1 các bảng M, N và O cho thấy cấp độ G4 của nhiễm trùng EHP với các ống đa ổ chứa các tế bào HP bị nhiễm (Hình 1m). Cả plasmodium đa nhân và bào tử trong tế bào chất của các tế bào bị ảnh hưởng cũng như các bào tử trong lòng ống đã được quan sát (Hình 1o).
Gan tụy của tôm SPF được thử thách bằng các chuỗi phân lấy từ tôm bị nhiễm EHP có kết quả dương tính với EHP khi sử dụng PCR lồng nhau trong tất cả các bể ở 3 độ mặn khác nhau. Điều này xác nhận sự hiện diện của EHP trong các bể xử lý cho thử thách 1 và thử thách 2. EHP được phát hiện ở cả 3 độ mặn được đánh giá (2 ppt, 15 ppt và 30 ppt). Mô gan tụy thu thập từ các động vật đối chứng âm tính được nuôi ở độ mặn 2 ppt, 15 ppt và 30 ppt đã được thử nghiệm âm tính với EHP khi sử dụng PCR lồng nhau.
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra một số con đường lây nhiễm bao gồm chung sống và tiêm trực tiếp vào gan tụy bằng chất gây nhiễm EHP. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lần đầu tiên báo cáo rằng phân có thể là con đường lây nhiễm. Do hành vi ăn mùn bã và sự hiện diện của thức ăn chưa tiêu hóa trong phân có thể chiếm khoảng 25–30%, tôm trong bể xử lý đã ăn nguồn thức ăn này cùng với các bào tử bị nhiễm EHP mô phỏng quá trình lây truyền theo chiều ngang được quan sát thấy ở cấp độ trang trại.
EHP, bao gồm sự hiện diện của ký sinh trùng trong tế bào chất của các tế bào bị nhiễm và chúng tôi đã tìm thấy các bào tử trưởng thành trong tế bào chất hoặc các bào tử được giải phóng trong gan tụy bằng phương pháp mô bệnh học ở tôm bị thách thức bởi EHP được nuôi ở các độ mặn khác nhau. Điều này khẳng định chắc chắn rằng EHP có thể gây nhiễm trùng ở nhiều độ mặn khác nhau, dao động từ 2 - 30 ppt. Khi lượng chất cấy ban đầu được sử dụng cho thử thách thực nghiệm thấp (tức là 1 × 103 bản sao của EHP/ng tổng DNA phân), tỷ lệ mắc HPM tương tự nhau (tức là 25%) bất kể độ mặn.
Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm EHP tăng ở độ mặn 30 ppt (87,5%), so với 15 ppt (30%) và độ mặn 2 ppt (33,3%), khi mức độ gây nhiễm vào tăng từ 1 × 103 lên 1 × 106 bản sao EHP/ ng tổng DNA phân trong thí nghiệm thử thách (thử thách 2). Thử thách phụ thuộc vào liều lượng đã được ghi nhận đầy đủ đối với các tác nhân gây bệnh tôm khác như AHPND và Hepatobacter penaei. Trong nghiên cứu hiện tại, loại gây nhiễm vào có số lượng bản sao thấp 1,6 × 103 được sử dụng trong thử thách số 1 đã gây ra các bệnh nhiễm trùng nhẹ ở tôm bị thử thách. Tuy nhiên, các trường hợp nhiễm trùng nặng (Cấp độ G3 đến G4) và tỷ lệ mắc bệnh cao hơn xảy ra ở thử thách 2 khi số lượng bản sao EHP cao hơn 1,1 × 106.
Các tổn thương mô học ở tôm được duy trì ở độ mặn 30 ppt nghiêm trọng hơn. Mức độ nhiễm trùng từ trung bình đến nặng (G3-G4) được tìm thấy ở 50% tôm bị ảnh hưởng. Ngược lại, chỉ có 16% tôm nuôi ở độ mặn 2 ppt cho thấy mức độ nhiễm trùng G3 và 0% tôm nuôi ở độ mặn 15 ppt cho thấy mức độ nhiễm trùng G2-G4. Sự khác biệt về mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng EHP ở 3 độ mặn khác nhau có thể là do tác động khác nhau của độ mặn đến sự nảy mầm của bào tử. Một trong những giai đoạn quan trọng trong quá trình nảy mầm của bào tử là sự gia tăng áp suất thẩm thấu trong bào tử. Sự khác biệt về độ mặn dẫn đến môi trường hạ trương (nồng độ thấp hơn) ở 2 ppt và 15 ppt so với môi trường ưu trương (nồng độ cao hơn) ở 30 ppt. Có khả năng dung dịch ưu trương sẽ thúc đẩy sự nảy mầm của bào tử bằng cách tăng quá trình hoạt hóa bào tử.
Độ cứng là một biến khác có sự khác biệt ở 3 độ mặn được sử dụng trong nghiên cứu này và có thể là một yếu tố ảnh hưởng đến sự nảy mầm của bào tử. Độ cứng ở độ mặn thấp (2 ppt) là khoảng 240 mg/L so với nước biển được tạo ra nhân tạo ở độ mặn 15 ppt và 30 ppt lần lượt là khoảng 787 và 1575 mg/L. Người ta đã báo cáo rằng canxi là một chất truyền tin thứ hai quan trọng kích hoạt nhiều sự kiện tế bào và dòng canxi chảy vào có thể, một phần, chịu trách nhiệm cho việc kích hoạt sự giải phóng vi bào tử ở độ mặn cao hơn.
Trong các ao nuôi thương phẩm của một số vùng đặc hữu EHP ở Châu Á, điều kiện độ mặn được phát hiện là thay đổi rất nhiều. Ví dụ, ở Ấn Độ có một số vùng nuôi tôm có độ mặn cao và thấp, và tỷ lệ mắc EHP dường như thấp hơn ở độ mặn thấp hơn (dưới 5 ppt), như đã quan sát thấy trong một cuộc khảo sát bệnh tôm ở Andhra Pradesh năm 2019. Các điều kiện tương tự đã được ghi nhận ở hai vùng nuôi tôm lớn ở Venezuela, tức là Hồ Maracaibo, nơi độ mặn khoảng 4–6 ppt và ở bang Falcon, nơi độ mặn thay đổi từ 36 đến 40 ppt. Ở Venezuela, hoạt động nuôi tôm không được tích hợp hoàn toàn và việc di chuyển nauplii và postlarvae giữa Falcon và khu vực Hồ Maracaibo là một hoạt động phổ biến. Điều này cho thấy rằng các PL và tôm bố mẹ bị nhiễm EHP đã được di chuyển giữa hai vùng này. Tuy nhiên, EHP chỉ được phát hiện ở khu vực Falcon, nơi độ mặn cao. Ở hồ Maracaibo, nơi có độ mặn thấp, EHP chưa được báo cáo. Một khả năng hạn chế sự lây lan của EHP có thể là sự khác biệt về độ mặn của nước.
Kết luận
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng các chuỗi phân từ tôm bị nhiễm EHP có thể được sử dụng làm nguồn gây nhiễm đáng tin cậy để tiến hành các đợt nhiễm trùng thực nghiệm EHP thông qua đường phân - miệng. Nhiễm trùng EHP có thể xảy ra ở độ mặn thấp (tức là 2 ppt) mặc dù tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm trọng của bệnh cao hơn ở độ mặn 30 ppt. Những phát hiện này có ý nghĩa trong việc quản lý bệnh ở các khu vực lưu hành EHP.
Nguồn: globalseafood
Dịch: Phòng Marketing Thần Vương